第128期糖類的分離純化及HPLC檢測

2020年03月17日來源：管理員

Part one 多糖

多糖（Polysacharides，PS），又稱多聚糖，是由10個以上的單糖通過苷鍵連接而成的，具有廣泛生物活性的天然大分子化合物。它廣泛分布于自然界高等植物、藻類、微生物（細(xì)菌和真菌）與動物體內(nèi)。20世紀(jì)60年代以來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)多糖具有復(fù)雜的、多方面的生物活性和功能：

(1) 多糖可作為廣譜免疫促進(jìn)劑，具有免疫調(diào)節(jié)功能，能治療風(fēng)濕病、慢性病毒性肝炎、癌癥等免疫系統(tǒng)疾病，甚至能抗AIDS病毒。如甘草多糖具有明顯的抗病毒和抗腫瘤作用，黑木耳多糖、銀杏外種皮多糖和蘆薈多糖可抗腫瘤和增強(qiáng)人體免疫功能。

(2) 多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗輻射，增強(qiáng)免疫功能等生物學(xué)作用，麥冬多糖具有降血糖及免疫增強(qiáng)作用，動物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能。

(3) 多糖能控制細(xì)胞分裂和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用，銀杏外種皮粗多糖具有抗衰老、抗過敏、降血脂、止咳祛痰、減肥等功能。

一、粗多糖的制備

生物體中的多糖，通過用熱水提取，乙醇沉淀，色素和蛋白的去除，最終獲得精制的粗多糖，下邊是對關(guān)于精制粗多糖的具體介紹。

1.1? 多糖的提取

表1 顯示的是從真菌、藻類和高等植物中提取制備粗多糖的過程。總體而言，從真菌、藻類和植物中提取多糖的方法以水提法為主，也有采用酶解的方法進(jìn)行提取，但是還是存在一些差異。對于真菌而言，需要先發(fā)酵，然后用不同溫度的熱水進(jìn)行提取。對于植物，則根據(jù)提取部位不同，如根、莖、葉、果皮、果肉、種子或整個植物，方法略有差異。比如從莖、葉子、果皮和整棵植株中提取多糖，由于這些部位常含有色素和一些脂類物質(zhì)，所以在提取前，常會選擇用乙醇、丙酮、甲醇或石油醚進(jìn)行預(yù)處理，以便除去一些脂類、色素和小分子物質(zhì)，然后再用熱水進(jìn)行提取。相比而言，果肉和根部所含色素等小分子物質(zhì)較少，則常常直接用髙溫的水進(jìn)行提取。對于藻類，因其中也會含有不同類型的色素，也會先用有機(jī)溶劑去除色素和小分子物質(zhì)，然后再用熱水進(jìn)行提取。表1顯示真菌、藻類和高等植物的多糖的沉淀劑大多是乙醇，也有個別采用丙酮。

表1 粗糖的制備

屬類	研究對象	粗糖的制備
真菌	大杯香菇	熱水提取→Sevag法去除蛋白→乙醇沉淀→冷凍干燥
	冬蟲夏草	熱水提取→乙醇沉淀→活性炭去色素→Sevag法去除蛋白 →乙醇沉淀→冷凍干燥
	杏鮑菇	沸水提取→乙醇沉淀→冷凍干燥
植物	荷葉	95%乙醇去除小分子→沸水提取→乙醇沉淀 →Sevag法去除蛋白→冷凍干燥
	心葉青牛膽	甲醇去除小分子→丙酮沉淀→三氯乙酸去除蛋白
	石斛粉末	丙酮和甲醇去除小分子→熱水提取→乙醇沉淀
	荔枝果肉	乙醇去除小分子→熱水提取→乙醇沉淀→冷凍干燥
	龍葵	石油醚和乙醇去除小分子→蒸餾水提取→乙醇沉淀
藻類	海帶	石油醚去除小分子→熱水提取→乙醇沉淀 →Sevag法去除蛋白→透析→冷凍干燥
動物	烏賊墨汁	上清液用木瓜蛋白酶酶解蛋白→沸水使酶失活 →Sevag法去除蛋白→乙醇沉淀

1.1? 多糖中雜質(zhì)的去除

粗多糖中往往混雜著蛋白質(zhì)、色素、低聚糖等雜質(zhì)，必須分別除去。

1.1.1????????? 蛋白質(zhì)的去除

去除蛋白質(zhì)常用的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、酶解法等。其中以Sevag法最常用，Sevag試劑是由一定比例的氯仿和正丁醇試劑組成，通常選擇氯仿:正丁醇＝4:1（v/v）。為了將蛋白盡可能多的去除，往往需要數(shù)次重復(fù)操作。另外，該方法很難將結(jié)合蛋白去除，往往是除去蛋白的同時，多糖也損失掉了。因而采用Sevag法去除蛋白存在以下幾個缺點：（1）有機(jī)試劑用量大；（2）試劑毒性大，污染嚴(yán)重；（3）效率低等缺點。近年，有些研究者采用酶解和經(jīng)典方法相結(jié)合來去除蛋白，該方法是在提取的過程中先加入合適的蛋白酶，將蛋白和多糖分離開，再采用Sevag法去除蛋白，該方法既提高了多糖的提取率，又減少了有機(jī)溶劑的使用。

1.1.2????????? 色素的去除

從生物體內(nèi)提取的多糖，尤其是從植物的莖、葉和果皮中提取的多糖往往含有大量的色素，這些色素嚴(yán)重影響著多糖的品質(zhì)。目前，去除這些色素的的方法主要有三種：（1）通過柱層析的方法進(jìn)行去除色素，例如大孔樹脂羅門哈斯的FPA98Cl。（2）通過吸附法去除色素，例如活性炭。（3）通過氧化法去除色素，例如低濃度的H₂O₂。

1.1.3????????? 小分子的去除

??? 盡管在從生物體中提取多糖時，很多研究者選擇用乙醇、丙酮、甲醇或石油醚進(jìn)行預(yù)處理，但是經(jīng)過乙醇沉淀，蛋白和色素的去除后，多糖中依然存在很多小分子，尤其是一些無機(jī)鹽、單糖和寡糖。對于無機(jī)鹽、單糖和寡糖等小分子物質(zhì)，可以采用透析法、超濾法等去除。

二、多糖的分離和純化

經(jīng)過前期對多糖的提取，去除蛋白質(zhì)、色素、小分子等物質(zhì)得到粗多糖，而這些粗多糖其實是由很多分子量、結(jié)構(gòu)不同的多糖混合而成。為了得到純的多糖即均一性多糖，仍需進(jìn)一步對這些粗多糖進(jìn)行分離純化。

2.1 分步沉淀法

多糖的結(jié)構(gòu)和分子量不同，其極性大小不同，在有機(jī)溶劑（如醇或酮）中的溶解度不同，根據(jù)這一原理，可以依此增加醇濃度，從而將多糖按分子量從大到小的沉淀出來。但是分級沉淀法一般得不到均一性多糖。仍需要借助柱層析法等進(jìn)一步純化，方可得到均一性的多糖。

2.2 柱層析法

要獲得均一性的多糖，一般是先經(jīng)過陰離子交換柱進(jìn)行粗步純化，然后再用凝膠柱進(jìn)一步純化。有些多糖也采用大孔樹脂柱進(jìn)行純化。下面對這三種柱層析法進(jìn)行詳細(xì)介紹。

2.2.1 陰離子交換法

一般使用陰離子交換柱對真菌、藻類和高等植物的多糖進(jìn)行初步分離。陰離子交換色譜常用的介質(zhì)有DEAE-纖維素、DEAE-瓊脂糖凝膠、DEAE-葡萄糖凝膠。最常用的有DEAE-52和DEAE-Sepharose。例如用DEAE-52柱對大杯香菇等菌類、玉米等植物、桑黃等藻類粗多糖進(jìn)行分離純化。使用DEAE-52填料進(jìn)行多糖的初步分離純化，該柱子一般直徑偏大，其中以2.6cm最多，操作過程中流動相的流速也較快，流速一般在0.7-2ml/min之間，以1ml/min最多，至于柱子的長度，選擇范圍較廣，從25-100cm不等。DEAE-Sepharose柱也常被用在對菌類、植物和藻類粗多糖的初步分離純化中，在選擇層析柱的直徑、流速和長度的方面與DEAE-52相似。DEAE-52或DEAE-Sepharose柱的流動相都是純水和不同濃度的NaCl溶液。

2.2.2 凝膠色譜法

凝膠色譜法根據(jù)被分離組分尺寸大小與凝膠的孔徑關(guān)系實現(xiàn)分離，類似于分子篩的作用。常用的凝膠有葡聚糖凝膠（Sephadex?G）、Sephadex LH-20、聚丙烯酸凝膠Toyopearl HW等。多糖的進(jìn)一步分離往往會選擇用各種凝膠進(jìn)行分離純化。選擇使用哪一種凝膠對多糖進(jìn)行純化的標(biāo)準(zhǔn)是多糖的分子量，不同種類和型號的凝膠能夠分離多糖類型和分子量范圍不同。凝膠柱的柱子規(guī)格常具有長而細(xì)的特點，直徑以1.6cm偏多。無論什么類型的凝膠柱，流動相多為蒸餾水或者一定濃度的NaCl溶液。

東曹的Toyopearl HW填料骨架為含羥基的親水性聚甲基丙烯酸樹脂，由于不含糖基，與其他做多糖的填料相比，不會和糖類樣品發(fā)生非特異性相互作用。

2.2.3 大孔樹脂柱色譜

大孔樹脂柱色譜是利用大孔樹脂的選擇性吸附作用和分子篩作用分離純化多糖。比如用AB-8大孔樹脂從青錢柳葉中分離純化出均一性多糖。

2.3 超濾法

超濾是以壓力為推動力的膜分離技術(shù)，應(yīng)用膜分離原理將小分子溶質(zhì)和溶劑除去而留下大分子溶質(zhì)，從而使大分子物質(zhì)得到純化。

表2 粗糖的進(jìn)一步分離純化

屬類	對象	填料	流動相	獲得的多糖
真菌	大杯香菇粗多糖	DEAE-52(2.6×30cm) → Sephadex G-100(2.6×60cm)	H₂O, 0.3,0.45M NaCl→ 0.1M NaCl	均一性多糖LGPS-1
真菌	杏鮑菇粗多糖	DEAE-52(2.6×40cm) → Sephadex G-100 (1.3×50cm)	H₂O，0.2,0.3,0.5M NaCl →H₂O	均一性多糖IPS-1和IPS-2
植物	荷葉粗多糖	DEAE-52(2.5×50cm) → Sephadex CL-6B (2.5×100cm)	H₂O → 0.1M NaCl	均一性多糖LLP
植物	荔枝果肉粗糖	DEAE-52(2.6×60cm) → Sephadex G-100 (2.0×40cm)	H₂O，0.1,0.2,0.3M NaCl →H₂O	均一性多糖 LP1,LP2,LP3
藻類	桑黃粗多糖	DEAE Sepharose FF(2.6×40cm) → Sephacryl S-400 HR (1.5×60cm)	0-0.2M NaCl →H₂O	均一性多糖 PL-A11

三、多糖的HPLC分析

通常情況下，使用尺寸排阻的柱子，用于多糖的分析。

四、多糖純化分析的設(shè)備

? ? 多糖是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，至少要超過10個以上的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，這類物質(zhì)的一個顯著特點是幾乎都沒有紫外吸收，或者很弱，在檢測手段上有它的獨特方法。

表8.png

1、多糖純化系統(tǒng)針對多糖沒有紫外吸收的特點特別選配原裝進(jìn)口Shodex示差折光檢測器和Rheodyne 7725i手動進(jìn)樣閥，保證系統(tǒng)的靈敏度和穩(wěn)定性。

2、輸液泵選配高精度柱塞泵，采用電子阻尼控制（Electrical Dump Control）和多點流量校正技術(shù)，有效控制流量脈動，保證最低基線噪聲和流量的精準(zhǔn)。

設(shè)備特點：

表9.png

Part two 單糖和寡糖

??? 下面繼續(xù)把單糖和寡糖的分離純化也做個簡單的介紹。

糖類化合物的分析包括三個步驟，提取、純化和分析。在糖提取的步驟中，選擇水、稀釋的堿溶液和有機(jī)溶劑在不同的溫度下對糖樣品進(jìn)行提取，提取溶劑的選擇需要根據(jù)目標(biāo)成本的類型來確定。糖純化的過程可以使用萃取、分級沉淀、鹽析、衍生、酶解、水解、柱色譜（包括纖維素、離子交換樹脂、凝膠、HPLC法等）方法。糖分析中，最常用的方法是色譜分離（包括氣相色譜法、毛細(xì)管電泳和液相色譜法）并與合適的檢測技術(shù)聯(lián)用（包括紫外、示差、蒸發(fā)光散射、質(zhì)譜和核磁共振等）。

??? 由于糖類的提取和純化都是類似的，前面做了詳細(xì)的介紹，所以單糖和寡糖的提取和純化步驟，這里就不再累述了，重點說說單糖和寡糖的高壓制備和HPLC分析。

一、高壓制備設(shè)備

表10.png

QuikSep 制備型中高壓層析系統(tǒng)根據(jù)流速范圍有50 ml/min至3000ml/min，根據(jù)客戶對產(chǎn)品制備量的要求，來選擇不同型號的系統(tǒng)。

1. QuikSep?系列純化系統(tǒng)秉承天然產(chǎn)物純化系統(tǒng)的所有優(yōu)點，并根據(jù)合成產(chǎn)物的特性，要求大量、快速的處理樣品，因此在輸液泵選擇上選用流量更高的型號；
2、輸液泵單向閥選用特有的PTFE材料，對石油醚、乙酸乙酯、丙酮、氯仿等一些強(qiáng)有機(jī)溶劑耐受性更好，更適合正相體系！
二、單糖、寡糖類樣品制備填料的選擇----FUJI CHROMATOREX NH SG Silica Gel

迄今為止，大多數(shù)糖類的分離介質(zhì)僅僅局限在分析級別，但是富士硅膠研發(fā)出用于制備色譜的新的氨基硅膠。當(dāng)使用高水相為流動相時，一般的氨基填料會暴露出很多問題。氨基硅膠的pH值很高，一般pH為9.0，在這樣高的pH條件下，目標(biāo)化合物一般都會變性，并且會毀壞硅膠基質(zhì)的表面。考慮到這些問題，富士公司研發(fā)出新的氨基硅膠填料，稱之為NH SG硅膠。NH SG硅膠可以最小化甚至是避免上述問題，并且對糖類化合物進(jìn)行更好的分離。

眾所周知，NH官能團(tuán)會和酮或者羧基發(fā)生反應(yīng)。但是，NH SG硅膠填料可以在有機(jī)相/水的流動相體積下分離大多數(shù)的糖類化合物，而不發(fā)生上述化學(xué)反應(yīng)。NH SG硅膠在正相條件下使用，尤其是親水相互作用模式（HILIC）。作為典型的HILIC模式，在增加水相比例的條件下，洗脫增強(qiáng)。

1. 單糖和二糖的分離

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